組織、細(xì)胞到底該如何裂解?
實(shí)驗(yàn)過程中難免會(huì)遇到特殊樣本比如組織和細(xì)胞,那我們我們又該如何來處理呢?常見的處理方法就是用RIPA來裂解。如發(fā)現(xiàn) RIPA 有沉淀,請放室溫半小時(shí)或者常溫水浴使沉淀溶解。根據(jù)使用量,取每 1ml RIPA 加入 10ul PMSF,使 PMSF 的終濃度為 1mM,混勻備用(PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加)。
1、樣品前處理:
a)對于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入
150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。
b)對于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液,用手
指輕彈懸浮細(xì)胞以充分裂解。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多,必需分裝成 5-10×10 5 細(xì)
胞/管,然后再裂解。
c)對于組織樣品:把組織剪切成細(xì)小的碎片。按照每 20mg 組織加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液
(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量) 。
用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。
2、后處理:
將裂解后的樣品 10000-14000g 離心 3-5 分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的蛋白濃度測定、SDS-PAGE、Western
blotting 和免疫沉淀等操作。
注意事項(xiàng) :
1、 使用本裂解液可以裂解細(xì)胞核,釋放出核蛋白的同時(shí),也會(huì)將基因組一并釋放出來,造成細(xì)胞裂解液粘
稠,此時(shí)可以直接加入蛋白上樣緩沖液煮沸再離心,離心后直接上樣電泳;若想測定濃度,可入加少量 SDS
(1%),煮沸后離心測濃度。
2、 本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑,所以不適合使用 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒,請
選擇 BCA 法或者 Lowry 法檢測蛋白濃度。
3、 如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物,隨后離心取上清
用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。